Anales Cientícos, 79 (2): 393 - 400 (2018)
ISSN 2519-7398 (Versión electrónica)
DOI: http://dx.doi.org/10.21704/ac.v79i2.903
Website: http://revistas.lamolina.edu.pe/index.php/acu/index
© Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima - Perú
Presentado: 27/03/2018
Aceptado: 12/12/2018
Identicación biomolecular y patogenicidad de Phytophthora, Pythium y
Phytopythium aislados de raíz y suelo en cítricos (Citrus spp.)
Biomolecular identication and pathogenicity of Phytophthora, Pythium and Phytopythium
isolated of root and soil in citrus tress (Citrus spp.)
Juan José Oviedo Quirós
1*
& Luz Leonor Mattos Calderón
2
*Autor de correspondencia
Resumen
El objetivo de esta investigación fue identicar las especies de Peronosporales presentes utilizando métodos moleculares.
Se recuperaron muestras de las raíces secundarias y suelo de ocho campos correspondientes a las cuatro principales
regiones productoras a lo largo de la costa peruana (Piura, Lambayeque, Lima e Ica). Los Peronosporales se aislaron
en medios de cultivo PAR, PARH y V8. La identicación molecular se realizó por amplicación de 730 - 820 pb de
la región del espaciador transcrito interno (ITS) y de 563 pb de la región del citocromo oxidasa II (Cox II) del ADNr,
usando cebadores ITS6/ITS4 y FM66/FM58 respectivamente. Los fragmentos amplicados se secuenciaron utilizando
la metodología de Sanger y la reconstrucción logenética se realizó con análisis bayesiano, utilizando dos millones de
generaciones. Los resultados formaron grupos con las secuencias de especies similares depositadas en el GenBank,
incluyendo: Phytophthora nicotianae, Phytopythium cucurbitacearum y Pp. vexans (aislados de raíz y de suelo), Ph.
parsiana y Pythium splendens (aislados de raíz), Py. aphanidermatum, Py. ultimun, Py. deliense, Pp. amazonianum
(aislados de suelo); además, se identicó una especie afín con Pythium guangxiense (aislado del suelo). Por otra parte,
se realizaron las pruebas de patogenicidad cumpliendo con los postulados de Koch para cada uno de los aislamientos
obtenidos, resultando patogénicos Ph. nicotianae, Ph. parsiana y Pp. vexans.
Palabras clave: Cítricos; Phytophthora; Pythium; Phytopythium; Identicación Biomolecular; ITS; Cox II; Análisis
Bayesiano.
Abstract
The aim of this research was to identify the Peronosporales species using molecular methods. Samples from both
secondary roots and soil were recovered from eight elds corresponding to the four main producing regions along the
Peruvian coast (Piura, Lambayeque, Lima and Ica). Peronosporales were isolated on PAR, PARH and V8 agar media.
Molecular identication was performed by amplication of 730 - 820 bp of the Internal Transcriptional Spacer (ITS) and
563 pb of Cytochrome Oxidase II (CoxII) regions of the rDNA, using ITS6/ITS4 and FM66/FM58 primers respectively.
The amplied fragments were sequenced using Sanger methodology and phylogenetic reconstruction was done with
Bayesian analysis, using two million generations. The results formed clusters with the similar species sequences
deposited in the GenBank, including: Phytophthora nicotianae, Phytopythium cucurbitacearum y Pp. vexans (root and
soil isolated), Ph. parsiana y Pythium splendens (root isolated), Py. aphanidermatum, Py. ultimun, Py. deliense, Pp.
amazonianum (soil isolated). Also, a species related to Pythium guangxiense (soil isolate) was also identied. On the
other hand, pathogenicity tests were carried out complying with Koch’s postulates for each of the isolations obtained,
resulting pathogenic Ph. nicotianae, Ph. parsiana and Pp. vexans.
Keywords: Citrus, Phytophthora; Pythiu;, Phytopythium; Biomolecular Identication; ITS; Cox II; Bayesian analysis.
1
Servicio Fitosanitario del Estado – Ministerio de Agricultura y Ganadería, apartado postal 1521-120 - San José, Costa Rica. Email: jjoviedoq@
gmail.com
2
Profesor principal, Departamento de Fitopatología, Facultad de Agronomía – Universidad Nacional Agraria La Molina, apartado postal 12-056 – La
Molina, Lima, Perú. Email: [email protected]
1. Introducción
Taxonómicamente los cítricos se encuentran dentro
del orden Genariales, la familia Rutacea, sub-familia
Aurantioideas, tribu Citreae, sub-tribu Citrinea y género
Citrus (Olivera, 1991).
Los cítricos verdaderos pertenecen a seis géneros
(Citrus, Clymenia, Eremocitrus, Fortunella, Microcitrus
y Poncirus), sin embargo, solo tres de estos géneros son
de importancia comercial: Poncirus (naranjo trifoliado),
Fortunella (Kumquat) y Citrus. Siendo las especies del
género Citrus, desde el punto de vista agronómico, las más
importantes (Agustí, 2003).
Los cítricos tienen su centro de origen en Asia oriental,
especícamente la vertiente cálida o meridional del
Himalaya hasta China meridional, Indochina, Tailandia,
Identicación biomolecular y patogenicidad de Phytophthora, Pythium y Phytopythium aislados de raíz y suelo en cítricos (Citrus spp.)
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Malasia e Indonesia (Davies & Albrigo, 1994; Anderson
et al., 1996). Todos los frutos cítricos de importancia
comercial aparentemente se han originado de especies
nativas del sudeste asiático (Mont, 1998a). Actualmente, el
cultivo de cítricos se desarrolla en casi todas las regiones
tropicales y sub-tropicales del mundo, contempladas entre
los paralelos 44° N y 41° S (Agustí, 2003).
Los cítricos están considerados en Perú, como uno de
los grupos de frutales de mayor importancia económica
tanto por el área total plantada como por la rentabilidad
alcanzada por hectárea (Franciosi, 1995).
La costa del Perú presenta un microclima ideal para la
producción de diferentes cultivos como los cítricos (Citrus
spp. L.) destinándose principalmente para la exportación.
En el año 2013,la producción nacional de limón fue de
228.47 tonelada y para el caso de mandarina 313.80
toneladas (MINAG-OEEE, 2014).
Una de las enfermedades que afecta a los cítricos es
la muerte descendente ocasionada por Peronosporales de
los géneros Phytophthora sp., Pythium sp. y Phytopythium
sp., los cuales causan pudrición o lesiones necróticas en
las raicillas absorbentes de los árboles, obstruyendo o
dicultando la absorción de agua y nutrientes por parte de
la planta. El efecto del daño se reeja en la parte aérea
donde se observa amarillamiento y decaimiento foliar,
un retraso en el crecimiento y la muerte descendente del
árbol, llegando a matarlo, lo cual afecta la productividad y
comercialización de estas frutas (Mont, 1997).
En el Perú hay escasos reportes de pseudohongos
radiculares, asociados a los cítricos. A la fecha las
pudriciones radiculares han sido atribuidas a Phytophthora
parasítica (Syn. Phytophthora nicotianae) Dastur, como
agente causal (Javier, 1998; Chumacera et al., 2004; Javier,
2004a; Javier, 2004b y Rodríguez-Gálvez y Maldonado,
2004). Actualmente en diferentes países, se mencionan
asociadas a diferentes cultivos especies de un nuevo
género de la familia Pythiaceae: Phytopythium Abad, de
Cock, Bala, Robideau, Lodhi & Lévesque (Bala et al.,
2010). Este género incluye individuos de características
morfológicas intermedias entre Phytophthora y Pythium
Por lo expuesto, se planteó como objetivo general de
la investigación determinar las especies de Peronosporales
que afectan el sistema radicular en las plantaciones de
cítricos a lo largo de la costa peruana.
2. Materiales y métodos
Aislamientos: Se recuperaron muestras de las raíces
secundarias y suelo de ocho campos correspondientes
a Piura, Lambayeque, Lima e Ica, principales regiones
productoras de cítricos a lo largo de la costa peruana, de
las cuales se obtuvieron aislamientos de pseudohongos en
dos medios selectivos, PAR (el cual utiliza como base Corn
Meal Agar (CMA) al cual se le adicionan tres antibióticos
(Pimaricina, Ampicilina y Rifampicina), y PARH (el
cual utiliza como base CMA más los tres antibióticos
mencionados y la adición de Hymexazol). La siembra
de las muestras (raíces y suelo) se realizó colocando
cinco puntos de siembra en cada uno de los medios
de cultivo, hasta obtener cultivos axénicos, las
placas sembradas se incubaron a 25 °C, el cultivo puro
se repicó en medio de cultivo Agar-V8 modicado (jugo
V8 50 % + extracto de avena 50 %), para favorecer el
desarrollo de micelio que fue utilizado en la extracción de.
Prueba de patogenicidad: se utilizaron plantas francas de
aproximadamente dos meses y medio de edad, contenidas
en bolsas plásticas con sustrato (arena, tierra de chacra
y compost en relación 1:1:1), las cuales fueron tratadas,
inmediatamente después de trasladadas e instaladas en el
invernadero, con Tiabendazol (250 cc / 200 l. de agua).
Dos meses posteriores a la desinfestación del sustrato, se
realizó la inoculación con zoosporas a una concentración
de 1 x 10
4
zoosporas / ml. de agua, aplicando 25 ml. por
planta.
Al no mostrar síntomas, trascurrido dos meses desde la
inoculación, se realizó una segunda inoculación utilizando
micelio, propagado en trigo, a razón de 5 gr. de trigo
inoculado por kilogramo de sustrato, usando entre 15 y 20
gr. de inóculo por planta.
Las plantas que presentaron síntomas secundarios
fueron procesadas (extracción y siembra de raicillas
en medio de cultivo CMA-PAR) antes de su muerte. La
totalidad de las plantas fueron procesadas a los tres meses
y medio de la primera inoculación (mes y medio después
de la segunda inoculación); para ello, se procedió a lavar
las raicillas y observar presencia de síntomas primarios
para re-aislar el patógeno inoculado y así cumplir con los
postulados de Koch.
Características culturales y morfológicas de las especies
patogénicas: La prueba de comprobación morfológica,
consistió en producir estructuras de propagación de los
diferentes aislamientos, para posteriormente realizar
montajes y observaciones microscópicas de las mismas,
comparando con las descripciones de diversos autores,
esta prueba se realizó tanto a los aislamientos obtenidos
inicialmente, para determinar su identidad con los
resultados biomoleculares; así como, los re-aislamientos
obtenidos de las plantas inoculadas, para comprobar que se
trató del mismo patógeno inoculado.
Análisis molecular: La extracción del ADN se realizó bajo
la metodología de Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
(CTAB) al 2 % (Doyle & Doyle, 1990). La prueba de PCR
se llevó a cabo siguiendo las observaciones de Spies et
al. (2011), utilizando los cebadores (primers) de la marca
Sigma-Aldrich (Tabla 1). El ADN de las muestras se
preparó mezclándolo con 7,86 µl. de H
2
O HPLC estéril;
3,00 µl. de Buffer para la Taq-polimerasa (Promega); 0,60
µl. de dNTP`s (Promega); 0,18 µl. de primer 1 0,18 µl. de
primer 2, 0,18 de Taq-polimerasa (Promega) y 3,00 µl. de
ADNr, obteniendo un volumen total de 15 µl. por muestra
y la reacción de PCR se efectuó en un termociclador Bio-
RAD (modelo C1000 Touch) siguiendo las siguientes
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condiciones de termociclado ITS: 94° C pro 3 min., 35
ciclos de (94° C por 1 min., 55° C por 1 min. y 72° C por
1 min.), 72° C por 10 min y 4° C al innito y Cox II: 94°
C pro 5 min., 30 ciclos de (94° C por 60 seg., 52° C por 60
seg. y 72° C por 2 min.), 72° C por 7 min y 4° C al innito.
mediante inferencia bayesiana con dos millones de
generaciones y FigTree (versión 1.4.3).
El árbol logenético se conformó con las secuencias
obtenidas y con secuencias descargadas de la mega base
GenBank, para conformar y respaldar los clados formados
con las secuencias
obtenidas. Además, se
utilizó la secuencia de
una especie totalmente
diferente para que
cumpla la función de
raíz del árbol.
3. Resultados y discusión
Pruebas de patogenicidad: de todas las especies
identicadas resultaron patogénicas Phytophthora
nicotianae, Phytophthora parsiana y Phytopythium
vexans (Figura 1), donde se puede observar que las
plantas presentaban síntomas aéreos de amarillamiento,
decaimiento y defoliación; mientras que los síntomas
radiculares que presentaron fueron pudrición radicular
y desprendimiento de la cubierta radicular quedando
descubiertos los cilindros vasculares; siendo Ph. nicotianae
el más agresivo.
Tabla 1. Relación de cebadores (Primers) usados para la amplicación y secuenciación de las
regiones de ITS, y Cox II
Región
Nombre
Primer.
Secuencia primer (5´- 3´). Referencia.
Longitud
fragmento
ITS
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
White et al. (1990)
730 - 882 bp
ITS6 GAA GGT GAA GTC GTA ACA AGG Cooke& Duncan (1997)
Cox II
FM58 CCA CAA ATT TCA CTA CAT TGA Martin (2000)
563bp
FM66 TAG GAT TTC AAG ATC CTG C Martin (2000)
Los productos de PCR se limpiaron utilizando 3,5 µl.
del producto de PCR y añadiendo 1,4 µl. de ExoSAP-IT
(Affymetrix) bajo un programa sencillo de termociclado
(15 minutos a 37° C y 15 minutos a 80° C).
Estudio logenético: el análisis bioinformático de las
secuencias se realizó con la ayuda de los programas
BioEdit Sequence Alignment Editor (versión 7.2.5),
BLAST del National Center for Biotechnology Information
(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), MEGA (versión
7), MrBayes (versión 3.2.6). Se analizaron las secuencias
Figura 1. Síntomas presentados en la prueba de patogenicidad en el cultivo de cítricos para los aislamientos: Phytophthora
nicotianae, A) parte aérea, B) raíces y C) pudrición radicular; Phytophthora parsiana, D) parte aérea, E) raíces y F)
pudrición radicular; y Phytopythium vexans, G) parte aérea, H) raíces y I) pudrición radicular (T = planta testigo)
Identicación biomolecular y patogenicidad de Phytophthora, Pythium y Phytopythium aislados de raíz y suelo en cítricos (Citrus spp.)
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Características culturales y morfológicas de las
especies patogénicas: en la Figura 2 se observa la forma
de crecimiento, de las diferentes especies, en medio de
cultivo CMA-PAR: Ph. nicotianae (A) toruloso y aéreo;
Ph.parsiana (B) claveloide y supercial y Pp. vexans (C)
asteroide y supercial.
Figura 2. Aislamientos obtenidos en medio selectivo PAR,
Phytophthora nicotianae (A), Phytophthora parsiana (B)
y Phytopythium vexans (C)
La Figura 3, describe algunas características
morfológicas de las especies patogénicas identicadas:
Ph. nicotianae (A), presenta zoosporangios (Zo)
claramente papilados y persistentes, de forma ovoide a
esféricos; clamidosporas (Cl) globosas tanto terminales
como intercalares; proliferación simpodial (Ps) y
micelio (Mi) hialino no septado, similar a lo descrito por
Waterhouse (1956), Erwin & Ribeiro (1996) y Gallegly
& Hong (2008). Mientras que, Ph. parsiana (C), presenta
zoosporangios (Zo) terminales, persistentes, no papilados
y de formas elipsoides a obpiriforme; la clamidospora (Cl)
es esférica y de paredes delgadas; presenta proliferación
interna (Pi) tipo anidado y su micelio (Mi) es hialino y
aseptado, características que coinciden con las descritas
por Mostowzadeh-Ghalamfarsa et al. (2008). Por otra
parte, en Pp. vexans(D), se observan zoosporangios (Zo)
globosos con tubo de descarga (Van der Plaats-Niterrink,
1981).
Figura 3. Estructuras morfológicas de las especies
patogénicas en estudio, (A) Phytophthoranicotianae,
(B) Phytophthora parsiana, (C) Phytopythium vexans.
Zoosporangio (Zo), clamidospora (Cl), micelio (Mi),
hinchamiento hifal (Hi), proliferación extendida (Pe),
proliferación simpodial (Ps), proliferación interna (Pi),
oogonio (Og), oospora (Os), anteridio (An). Bar = 10 µ
Análisis molecular: en el Tabla 2 se detallan las especies
de los géneros Phytophthora, Pythium y Phytopythium
identicados a través del método de PCR para las regiones
ITS y Cox II.
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Tabla 2. Especies de Phytophthora, Pythium y Phytopythium identicados, biomolecularmente (regiones ITS y Cox II),
para cítricos, de las diferentes regiones muestreadas a lo largo de la costa peruana
Patrón Género / especie Lugar Distrito Región
Limón rugoso
Phytophthora nicotianae
Guapalas
Chulucanas. Piura
Pythium splendens
Chulucanas
Pythium deliense
Guapalas
Phytopythium vexans
Guapalas
Phytopythium cucurbitacearum
Chulucanas
Limón rugoso
Phytophthora nicotianae
San Isidro
Motupe Lambayeque
Pythium sp.
El Carmen
Pythium aphanidermatum
San Isidro y El Carmen
Phytopythium vexans
San Isidro
Limón rugoso
Phytophthora nicotianae
San Miguel, (Irrigacion Santa Rosa).
San Miguel
Lima (Hua-
ral)
Limón rugoso
Phytophthora parsiana
San Miguel, (Irrigacion Santa Rosa).
Mandarina Cleopatra
Phytophthora nicotianae
La Villa, (Irrigacion Santa Rosa).
Huaral
Mandarina Cleopatra
Pythium ultimum
La Villa, (Irrigacion Santa Rosa).
Naranja Swingle
Phytopythium vexans
Pampa de los Castillos Los Aquijes
Ica
Limón Criollo
Phytopythium amazonianum
San Juan Baustista. San Juan Bautista
de Piura de los cultivos de cítricos, se puede presumir que
la división se puede dar por una diferencia genética entre
los subclados; el Clado IX, lo conforman dos aislamientos
del Pp. amazonianum obtenidos del cultivo de cítricos
procedente de Ica y las dos únicas secuencias existentes en
el GenBank, esta especie no presenta reporte ni descripción
morfológica y por último el Clado X, está conformado por
un único aislamiento obtenido de Ph. parsiana de cítricos
procedente de Lima (Huaral), el cual se agrupó con las
secuencias descargadas para la especie.
Los resultados obtenidos por la identicación
biomolecular, las pruebas de patogenicidad y el
cumplimiento de los postulados de Koch, permiten
conrmar la presencia de Ph. nicotianae en los cultivos
de cítricos, raticando lo previamente descrito por varios
autores. Numerosos estudios mediante identicación
morfológica, han propuesto a Ph. nicotianae como el
agente causal de la pudrición radicular en cítricos (Javier,
1998; Chumacera et al., 2004; Javier, 2004a; Javier,
2004b, Rodríguez-Gálvez y Maldonado, 2004). Además
Mont (1997) menciona en su descripción de la chupadera
fungosa que uno de los agentes causales, pueden ser
especies de Phytophthora que afectan la envoltura externa
de las raicillas. Este mismo autor menciona que Ph.
parasítica (Syn. Ph. nicotianae) es uno de los agentes
causales de la gomosis del cuello en cítricos, señalando que
afecta las raicillas de los árboles. Anteriormente, García
y Stevenson (1942) ya habían reportado la presencia de
Ph. parasitica (Syn. Ph. nicotianae) en cítricos en la
zona de Chanchamayo, departamento de La Libertad; de
igual manera García (1947) indicó que este pseudohongo
se encontraba afectando plantaciones de cítricos en los
departamentos de Ancash, Arequipa (Camaná), Huánuco,
Junín (Chanchamayo), La Libertad y Piura (Canchaque);
así como, lo mencionan Bazán y Dongo (1965) y Bazán
(1973; 1975).
Las secuencias de los aislamientos de estos tres géneros,
para la obtención de árboles logenéticos de la región ITS
del ADN ribosomal, fueron analizadas mediante inferencia
bayesiana con dos millones de generaciones, de igual
manera, se obtuvieron secuencias conrmatorias de las
especies en estudio, para la región Cox II del ADNr.
Estudios logenéticos: en el árbol logenético del
género (Figura 4), se conformaron diez clados: el Clado
I, incluye a todos los aislamientos obtenidos de Ph.
nicotianae procedentes de los cultivos de cítricos de Piura,
Lambayeque y de Lima (Huaral), los cuales se agrupan
adecuadamente con las secuencias descargadas para esta
especie; el Clado II, constituido por un aislamiento de
Py. deliense obtenido del cultivo de cítricos procedente
de Piura y de secuencias descargadas; el Clado III,
comprende aislamientos de Py. aphanidermatum de
cítricos procedentes de Lambayeque y de las secuencias
descargadas para esta especie; el Clado IV, corresponde a
un aislamiento de Pythium sp. de cítricos procedente de
Lambayeque, que se agrupó con la secuencia descargada
de Py. guangxiense, sugiriendo que estas dos especies están
estrechamente emparentadas; el Clado V, está conformado
por un aislamiento de Py. splendens del cultivo de cítricos
procedente de Piura, así como de las secuencias descargadas
para esta especie; el Clado VI, lo conforma un aislamiento
de Py. ultimum del cultivo de cítricos procedente de Lima
(Huaral) y de secuencias descargadas para esta especie;
el Clado VII, está constituido por aislamientos de Pp.
vexans del cultivo de cítricos procedente de Piura, Ica, y
Lambayeque, además de secuencias descargadas para la
especie; el Clado VIII quedó subdividido en dos, ambos
subclados están conformados por aislamientos de Pp.
cucurbitacearum como de secuencias descargadas para
la especie, los aislamientos en ambos subclados proceden
Identicación biomolecular y patogenicidad de Phytophthora, Pythium y Phytopythium aislados de raíz y suelo en cítricos (Citrus spp.)
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Figura 4. Árbol logenético construido con secuencias correspondientes al ADNr del Espacio Transcrito Interno (ITS) de
Phythophthora sp., Pythium sp. y Phytopythium sp., usando inferencia Bayesiana
(aislados en estudio, resaltados en negrita)
J. J. Oviedo & L. L. Mattos / Anales Cientícos 79 (2): 393 - 400 (2018)
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En el caso de Ph. parsiana detectada en cítricos,
solamente se obtuvo un aislamiento de la zona muestreada
en Lima (Huaral), el cual corresponde a una muestra
de raíz y no se encontraron reportes a nivel nacional de
esta especie afectando cultivos de cítricos. Sin embargo,
Ph. parsiana fue reportada por primera vez como nueva
especie del clado 9 de Phytophthora, afectando pistacho
(Pistacia vera L.) en Irán y Estados Unidos, higo (Ficus
carica L.) en Irán y almendra (Prunus dulcis Mill.) en
Grecia (Mostowzadeh-Ghalamfarsa et al., 2008); y
afectando frutos de cítricos mediante una inoculación
articial (Hajebrahimi and Banihashemi, 2011).
Por otra parte, no existen reportes o estudios a nivel
nacional para el género Phytopythium. Sin embargo, a nivel
internacional Timmer et al. (2015) señala a Pp. vexans como
el agente causal de “Damping-off” en cítricos, no obstante,
antes del año 2010 donde se dio el surgimiento del género
Phytopythium y la migración del clado K de Pythium a este
nuevo género, en el Perú se reportaba a Pythium sp. como
el agente causal de la pudrición radicular en palto (Bazán y
Dongo, 1965; Bazán, 1973). Además, para Estados Unidos
y Canadá se reporta Pp. vexans en los cultivos de cítricos
(Harvey, 1944b; Hendrix& Campbell, 1968) coincidiendo
con los resultados obtenidos en este estudio.
4. Conclusiones
Se logró identicar biomolecularmente mediante
secuenciamiento de las regiones ITS y CoxII, así como
raticar con las características morfológicas, a los
pseudohongos radiculares asociados al cultivo de cítricos
(Citrus spp.): Ph. nicotianae, Ph. parsiana, Pythium sp.,
Py. aphanidermatum, Py. deliense, Py. splendens, Py.
ultimum, Pp. amazonianum, Pp. cucurbitacearum y Pp.
vexans. Después de realizadas las pruebas de patogenicidad
cumpliendo con los postulados de Koch, se determinó que
los agentes causales de la pudrición radicular a lo largo de
la costa peruana son: Ph. nicotianae, Ph. parsiana y Pp.
vexans en el cultivo de cítricos (Citrus spp.), considerando
las dos últimas especies como un primer reporte para el
Perú.
5. Agradecimientos
• Al Servicio Fitosanitario del Estrado (SFE) – Ministerio
de Agricultura y Ganadería (MAG) de Costa Rica, por
la beca otorgada para el estudio de la especialidad en
Fitopatología.
• Al Departamento de Fitopatología de la Universidad
Nacional Agraria L Molina (UNALM) en Perú, por
brindarme y facilitarme los equipos y ambientes para el
desarrollo de la investigación.
• Al Instituto de Biotecnología (IBT) de la Universidad
Nacional Agraria la Molina (UNALM) en Perú, por la
capacitación, prestamo de equipos e instalaciones del
laboratorio para la extracción de ADN.
• A la Dra. Hilda Silva Rojas, directora del Laboratorio
de Biotecnología y Patología de Semillas del
Colegio de Postgraduados (campus Montecillo) en
México, por la capacitación, prestamo de equipos,
reactivos e instalaciones del laboratorio para realizar
procedimientos de PCR, secuenciación y análisis
bioinformático.
6. Literatura citada
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España. 422 p.
Anderson, C.; Ban, G.; Beñatena, H.; Casafus, C.; Costa,
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1996. Manual para productores de naranja y mandarina
de la región del Río Uruguay (en línea). INTA (Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria). Eds. A. Fabiani,
R. Mika, L. Larocca y C. Anderson. Argentina. (Serie A
N° 2, Diversicación Productiva). Disponible en: http://
inta.gob.ar/documentos/manual-para-productores-de-
naranja-y-mandarina-de-la-region-del-rio-uruguay/
Bala, K.; Robideau, G.P.; Levesque, C.A.; de Cock, A.W.
A.M.; Abad, G.; Lodhi, A.M.; Shahsad, S.; Ghaffar, A.
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Phytopythium sindhum Lodhi, Shahzad & Levesque,
sp. nov. Fungal Planet 49. Persoonia, 24: 136-137.
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